人多能干细胞向雌性生殖细胞诱导分化的研究

【摘要】已有研究表明，胚胎干细胞和诱导多能干细胞在体外特定诱导条件下，能够向雌性生殖细胞发生分化。而且，通过与性腺体细胞共同组成“重组卵巢”后能进一步产生后代。由于受到材料来源和伦理学的限制，关于人雌性生殖细胞体外分化的报道较少。因此，我们利用特定的人羊水干细胞（humanAmnioticFluidStemCells，hAFSCs）和胚胎多能干细胞（humanEmbryonicStemCells，hESCs）作为模式细胞，通过添加猪卵泡液（porcineFollicleFluid，pFF）对人多能干细胞进行诱导，使其定向分化为雌性生殖细胞，具体研究内容和结果如下：1.人羊水干细胞的培养和鉴定将本实验室分离得到的hAFSCs细胞系070607株（46XX）、070609株（46XX）和091122株（46XY）进行复苏。经体外培养后，选取代次较低的hAFSCs，通过RT-PCR、流式细胞分选和免疫荧光组化等方法，检测三株细胞系多能性基因、细胞表面抗原和蛋白质的表达。结果发现070607细胞株的生长活力最佳，表达胚胎多能干细胞标记基因OCT4、NANOG和CD117，间充质干细胞标记基因CD90、CD44和CD29，不表达造血干细胞基因CD45；在蛋白质水平表达OCT4、SOX2、SSEA-4、TRA-1-60和CD117；同时，该株细胞含有间充质干细胞表面标志物CD29（99.2%）、CD117（99.8%）、CD44（99.8%），缺乏造血干细胞表面标记物CD34（0.1%）和CD45（0.1%）。2.人羊水干细胞向雌性生殖细胞的诱导分化采用两步法对070607株hAFSCs细胞进行诱导。首先将细胞培养在添加pFF的生殖细胞培养基中进行初步诱导，10~15天后，将形成的细胞集落转移到含有激素和生长因子的卵母细胞培养基中，对这些细胞集落进行二次诱导。诱导过程中，能发现处于不同阶段的雌性生殖细胞出现，如原始卵泡、次级卵泡、卵丘卵母细胞复合体和卵母细胞等。通过实时定量PCR检测显示，生殖细胞相关基因OCT4、IFITM3、DAZL、FIGLA、FSHR、CYP17和P450出现明显上调。诱导后期表达减数分裂基因DMC1和颗粒细胞特异性基因FOXL2。通过放射免疫法检测发现，诱导后的细胞能产生雌二醇；经流式细胞仪对DNA含量进行分析后发现，细胞发生了单倍体化。同时，在诱导不同时间，瞬时转染卵母细胞特异性报告载体pBMP15-EGFP，发现在诱导后10天后，体积较大的圆细胞呈GFP阳性，证明该细胞表达BMP15蛋白。采用免疫荧光组化的方法，检测到诱导后的生殖细胞表达特异性蛋白OCT4、NANOG、CD117和ZP2。而且，通过免疫印迹法也检测到ZP2蛋白的表达。除此之外，诱导后期能观察到形态类似于孤雌胚胎的细胞。上述结果显示，在本研究提供的诱导培养条件下，hAFSCs能够定向分化为雌性生殖细胞。3.人胚胎干细胞的培养、鉴定及其向雌性生殖细胞的诱导分化采用小鼠胎儿成纤维饲养层和无饲养层培养体系，对hESCs系H1（46XY）和H9（46XX）进行培养。检测发现，hESCs表达多能性相关的标记基因（OCT4和NANOG）和蛋白（OCT4、SOX2、TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA-4），在小鼠胎儿成纤维饲养层的培养条件下，能形成形态更加均一的类胚体。通过对hESCs的定向分化发现，单层细胞培养能够形成雌性生殖细胞。表达生殖细胞相关基因CD29、DAZL、STELLA、DMC1、BMP15和GDF9等。而通过类胚体诱导则向滋养层细胞发生了分化。
【作者】俞晓丽；
【导师】王华岩；
【作者基本信息】西北农林科技大学，临床兽医学，2014，博士
【关键词】人；羊水干细胞；胚胎干细胞；分化；雌性生殖细胞；

【参考文献】
[1]丁为.华能大厦岩土工程项目技术风险评价及控制[D].吉林大学,项目管理,2013,硕士.
[2]王俊朝.中部三大城市群结构形态比较研究[D].湖南大学,建筑学,2011,硕士.
[3]宋旭东,向铁元,熊虎,徐智.考虑碳排放权分配的低碳电源规划[J].电力系统自动化,2012,19:47-52.
[4]郭云财.基于局所分叉理论的圆筒件充液拉深成形工艺优化[D].燕山大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[5]刘思思.PBLZST反铁电陶瓷制备工艺研究[D].华中科技大学,软件工程,2013,硕士.
[6]韩慧.基于GPU的医学图像算法研究与应用[D].西安电子科技大学,软件工程,2011,硕士.
[7]李贵海.电池SOC估算策略研究[D].浙江大学,2006.
[8]梁荣余.适合于中小城市公安交警专网的规划设计[D].山东大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[9]耿倩倩.农地流转背景下的我国土地银行发展模式研究[D].河南科技大学,农村与区域发展（专业学位）,2014,硕士.
[10]张宏大.基于高速以太网的入侵检测系统的研究[D].大连理工大学,计算机科学与技术,2003,硕士.
[11]朱虹.活性氧、p66~(shc)与高浓度葡萄糖下小鼠胚胎发育阻滞的相关性研究[D].郑州大学,生殖医学,2013,硕士.
[12]吴志鸿,廖森,王建设,黄旭雄.新法合成碱式碳酸铝镁[J].化工技术与开发,2004,03:8-11+15.
[13]张竞雄.基于SVPWM无刷双馈电机矢量控制系统场路耦合有限元的仿真研究[D].北京交通大学,2014.
[14]孙攀峰.苹果渣的营养价值评定及其饲喂奶牛的效果研究[D].河南农业大学,动物营养与饲料科学,2004,硕士.
[15]房钰鑫.多种分子识别生物传感活性界面的构建及其应用研究[D].南开大学,2013.
[16]高镜惠.柴油机红外再生微粒捕集器电路控制系统研究与开发[D].大连理工大学,车辆工程,2004,硕士.
[17]刘霈珈.河南省温县吨粮田的耕地质量分析与高标准基本农田建设[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2014,硕士.
[18]杨宇海.打造学校特色研究[D].华东师范大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[19]文佐.齐白石山水画研究[D].湖南师范大学,美术学,2013,硕士.
[20]林芬芳.漳州市区建筑物震害预测及防御对策[D].重庆大学,建筑与土木工程,2003,硕士.
[21]吴文利.泰国学生对现代汉语连词“而”的认知[D].广西民族大学,文学,2013,硕士.
[22]韩旭.校本课程开发对思想政治课教师的挑战[D].东北师范大学,教育,2003,硕士.
[23]王帅.内蒙古高校毕业生就业难问题分析与对策研究[D].内蒙古师范大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[24]邹宏军.9Cr2Mo钢冷轧中间辊堆焊修复工艺研究及工程应用[D].重庆大学,材料工程,2003,硕士.
[25]隋东硼.计及冲击电晕的500kV变电站雷电过电压计算及防雷措施研究[D].沈阳工业大学,电气工程,2013,硕士.
[26]李良贺.春秋时期的卜筮研究[D].吉林大学,中国古代史,2004,硕士.
[27]李赵雪.石油工程安装决策支持分析系统开发与研究[D].大连理工大学,机械电子工程,2004,硕士.
[28]张鹏飞,江道灼,刘华蕾.带旁路限流电感的新型固态限流器试验研究[J].电力系统自动化,2005,04:67-71+87.
[29]崔家才.几类非线性分数阶微分方程解的存在性[D].曲阜师范大学,应用数学,2013,硕士.
[30]曹亮.全业务环境下GX移动园区客户营销服务研究[D].电子科技大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[31]张丽红.坐标测量机与制造信息化平台数据通讯的研究[D].西安理工大学,测试计量技术及仪器,2004,硕士.
[32]宋绍华.浒苔挥发性风味成分及其在加工过程中的变化分析[D].宁波大学,食品工程（专业学位）,2013,硕士.
[33]张浩力,赵敏,周凯歌.二维纳米材料的液相剥离法制备及其非线性光学性质研究[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——论坛七：中新青年化学家论坛[C].中国化学会:,2014:1.
[34]詹韩晖.证券投资基金绩效及其评价体系研究[D].暨南大学,2002.
[35]刘家磊.论刑事证据的性质[D].安徽大学,诉讼法学,2013,硕士.
[36]刘翠.西安市环境空气质量污染变化特征与影响因素研究[D].西北大学,环境科学,2013,硕士.
[37]赵薇.宽带信道参数提取算法的应用研究[D].南京邮电大学,电磁场与微波技术,2013,硕士.
[38]李劲松.关于我国工程勘察设计单位企业化的基本思路及加入WTO后的应对措施[D].西南财经大学,工商管理,2003,硕士.
[39]米利.胶体晶体弹性模量测量及光散射方法测量胶体聚集速率[D].山东师范大学,物理化学,2013,硕士.
[40]赵训婷.基于网络拓扑的城轨CBTC系统数据自动生成研究[D].北京交通大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[41]柳艳鸿.美国教育史学流派研究[D].河北大学,教育史,2003,硕士.
[42]文艺.风力发电系统中储能容量优化配置[D].华中科技大学,电气工程,2013,硕士.
[43]任笑.红光牌绵白糖“消费品客户”购买决定因素研究[D].吉林财经大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[44]董柏.域名反向劫持的法律规制研究[D].华中科技大学,法律,2013,硕士.
[45]周婷婷.基于字典的超分辨率算法研究及其应用[D].湖北大学,应用数学,2012,硕士.
[46]王松岩,于继来.短时风速概率分布的混合威布尔逼近方法[J].电力系统自动化,2010,06:89-93.
[47]成蓉,程惠芳.中印贸易关系:竞争或互补——基于商品贸易与服务贸易的全视角分析[J].国际贸易问题,2011,06:85-94.
[48]王亮,段福庆,吕科.基于HEIV模型的摄像机一维标定[J].自动化学报,2014,04:643-652.
[49]王旭.磁性埃洛石吸附水溶液中四环素类抗生素的研究[D].长安大学,环境工程,2013,硕士.
[50]张贝.移动端视觉界面的繁简性研究[D].北京交通大学,2015.